1. 技術文章Article 首 頁 > 技術文章 > 細胞多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)活性比色法定量檢測試劑盒
      細胞多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)活性比色法定量檢測試劑盒
      點擊次數:82 發布時間:2023-06-25
       


       技術背景

       

      多聚ADP核糖聚合酶-1Poly (ADP-ribose) Polymerase;PARP;EC 2.4.2.30)是一種鋅依賴性核酶,廣泛存在于真核細胞中。PARP家屬由18個成員,其中6個已經被證實,包括PARP-1(占90%)、PARP-2、PARP-3、PARP-4VPARP)、PARP-5a/5btankyrase)等。PARP蛋白由4個結構域構成:DNA結合、切離、自修飾(automodification)、催化等結構域。其功能在于特異性地識別DNA損傷產生的單鏈或雙鏈DNA斷裂,并與之結合而激活,催化將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD轉化煙酰胺nicotinamide和多聚ADP核糖分枝聚合體(branched polymers of various poly (ADP-ribose))的反應,由此導各種DNA修復蛋白聚集到損傷部位,實施修復,同時調節染色質結構形成(chromatin structure formation)、 細胞分化、繁殖、發育、凋亡、基因表達等,以及對于心腦缺血的反應和腫瘤惡變的作用。抑制PARP活性,可以防止心衰、中風、敗血癥等引起的組織損害。其中PARP-11014氨基酸殘基組成,分子量113Kd,是細胞ATP/NAD細胞凋亡系統的主要調節因子。基于人工合成底物ADP核糖對硝基苯酚(ADP-ribose-p-nitrophenol),在損傷的DNA存在的前提下,受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用,釋放出顯色產物對硝基苯酚(p-nitrophenol),通過分光光度儀檢測吸光讀數的變化405nm 波長,來定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。反應系統為:

       

       

      產品內容

       

      清理液(Reagent A        毫升

      裂解液(Reagent B        毫升

      緩沖液(Reagent C        毫升

      反應液(Reagent D        微升

      底物液(Reagent E          微升

      陰性液(Reagent F          微升

      產品說明書              1

       

       

       

      保存方式

       

      保存裂解液(Reagent B)、反應液(Reagent D)和底物液(Reagent E在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里;底物液(Reagent E避免光照;有效保證6

       

      用戶自備

       

      1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器

      15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

      細胞刮脫棒:用于脫離貼壁細胞

      (微型)臺式離心機:用于樣品制備

      比色皿或酶標板:用于比色的容器

      分光光度儀或酶標儀:用于比色分析

       

      實驗步驟

       

      實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

       

      一、 樣品準備(總蛋白制備)

       

      1. 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 106細胞)

      2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長表面

      3. 小心抽去清理液

      4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化

      5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細胞

      6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始

      7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

      8. 小心抽去上清液

      9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻

      10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

      11. 強力渦旋震蕩15

      12. 置于冰槽里孵育30分鐘

      13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

      14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

      15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1

      16. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

       

      二、 測定準備

       

      1. 開啟并設定好分光光度儀(溫度為25℃):波長405nm,并置零 

      2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;底物液(Reagent E避免光照;緩沖液(Reagent C室溫下預熱

      三、 背景對照測定

       

      1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

      2. 加入xx微升反應液(Reagent D

      3. 加入xx微升底物液(Reagent E

      4. 加入xx微升陰性液(Reagent F

      5. 上下傾倒數次,混勻

      6. 25℃溫度下孵育2小時

      7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景讀數

       

      四、 樣品測定

       

      1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

      2. 加入xx微升反應液(Reagent D

      3. 加入xx微升底物液(Reagent E

      4. 加入5微升待測樣品((20微克蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白))(注意:樣品須清澈

      5. 上下傾倒數次,混勻

      6. 25℃溫度下孵育2小時

      7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數

       

      五、計算樣品活性

       

       

      六、 酶標板測定

       

      1. 96孔酶標板上做好相應標記:背景對照和樣品

      2. 分別移取xx微升緩沖液(Reagent C96孔板中

      3. 分別加入xx微升反應液(Reagent D

      4. 分別加入xx微升底物液(Reagent E

      5. 分別加入xx微升陰性液(Reagent F待測樣品(20微克蛋白或100微克細胞裂解萃取液蛋白)到相應孔中(注意:樣品須清澈

      6. 輕輕搖動酶標板

      7. 25℃溫度下孵育2小時

      8. 即刻放進酶標儀檢測:獲得背景讀數和樣品讀數

      9. 活性計算:

       

       

      注意事項

       

      1. 本產品為20次操作,包括背景對照

      2. 操作時,須戴手套

      3. 系統操作過程中,背景測定只需1

      4. 樣品須澄清,至關重要 

      5. 用戶可以選擇使用核蛋白替代產品中的總蛋白制備

      6. 測定值由低到高變化;反應可持續2小時

      7. 比色測定后,比色皿須清洗

      8. 樣本測定2小時讀數高于背景讀數表明具有酶活性

      9. 建議待測樣本蛋白濃度:核蛋白20微克/5微升;總蛋白為100微克/5微升(本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1

      10. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

      11. 多聚ADP核糖聚合酶-1單位活性定義為:在25℃,pH 8.0條件下,每小時內能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位

      12. 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產品

       

      質量標準

       

      1. 本產品經鑒定性能穩定

      2. 本產品經鑒定檢測敏感

       

       


       
      一本天堂ⅴ无码亚洲道久久91_亚洲日本一区二区三区_亚洲有码视频_欧洲激情国产一区二区在线观看