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主要用途

細胞基質金屬蛋白酶 3（MMP-3）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過含硫多肽底物以及特定抑制劑

存在與否的情況下，受到 MMP3 的水解，釋放出巰基，進而使用 Ellman 試劑，產生黃色 5-巰基-2-硝基苯

甲酸產物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術

經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣

品中基質金屬蛋白酶 3 的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操

作簡捷，性能穩定，安全可靠。 技術背景

基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結構高度同源的分泌型或膜相關性鋅內肽酶的

總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質成分。迄今為止發現的MMPs至少

有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發育、形態

形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發生，例如關節炎、癌細胞

浸入轉移等。根據降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，

主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，

主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；

（4）膜型金屬蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內

絕大多數細胞并不儲備MMPs，當需要MMPs的信號傳遞到細胞后才臨時合成，合成的MMPs以無活性的酶

原（proenzyme）形式分泌到細胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs 可激活另一種MMPs，形成瀑布效應?；|金屬蛋白酶-3（EC3.4.24.17），又稱基質裂解素1（stromelysin-1）、

轉換素1（transin-1）或蛋白多糖酶（proteoglycanase），是糖基化細胞外基質蛋白酶，其前體分子量為55至

59kDa，激活后分子量為21至48kDa。它在血清或細胞上清中濃度通常為10至200納克/毫升。它的作用目標

是膠原蛋白III、IV、V、IX（collagens）、纖維連接蛋白（fibronectin）、彈性纖維蛋白（elastin）、層粘連

蛋白 （laminin）、纖溶酶原（plasminogen）、HB-EGF、E-鈣粘附蛋白（E-cadherin）、其它MMP（2、7、

8、9、13）、TIMP2、IL-1β、MBP、明膠、蛋白聚糖（aggrecan）、串珠素（perlecan）、核心蛋白聚糖（decorin）、

骨粘連蛋白（osteonectin）、卵白抑制素（ovostatin）、entactin等?；|金屬蛋白酶-3降解各種細胞外基質

成分，并作為絲氨酸類（serpin type）蛋白酶抑制劑。與腫瘤促發、結締組織重塑（remodeling）、傷口修復、

動脈粥樣硬化進展等疾病有關?；诤蚨嚯模╰hiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）

-LG-OC2H5，在特異性抑制劑UK356618存在與否的條件下，受到MMP3的水解，釋放出巰基（sulfhydryl

group），進而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反

應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm 波長），來定量測定細胞基質金屬蛋白酶3的特異活性?；|金屬蛋白酶3反應系統為： 產品內容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

2

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應液（Reagent D） 毫升

底物液（Reagent E） 微升

陰性液（Reagent F） 微升

專性液（Reagent G） 微升

產品說明書 1 份

保存方式

保存反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；緩沖液（Reagent

C）保存在室溫下；其余的保存在 4℃冰箱里；反應液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent

G）避免光照；有效保證 3 月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于反應液配制的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

培養箱：用于反應孵育

200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準備

1． 準備好 75cm2細胞培養瓶或 100mm 細胞培養皿的待測培養細胞（1 至 5 X 10

7細胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉移到預冷的 1.5 毫升離心管

11．強力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA 蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）

16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

3

二、 測定準備

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長 412nm，間隔 1 分鐘，讀數 15 次（共 15 分鐘），并置

零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 （選擇步驟）樣品背景對照測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升陰性液（Reagent F）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（15 分鐘讀數－0 分鐘讀數）

四、 樣品總活性測定

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15 分鐘讀數－0 分鐘讀數）

五、樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取 10 微升待測樣品（100 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

G），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升反應液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

6． 加入 20 微升上述預處理的待測樣品

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15 分鐘讀數－0 分鐘讀數）

六、計算樣品活性

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（一） 樣品活性（總活性或非特異活性）

（二） 樣品特異活性

七、 酶標儀測定

（一） 樣品總活性檢測

1． 在 96 孔板上做好相應標記：樣品背景（選擇步驟）和樣品活性

2． 分別移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中的所有孔里

3． 分別加入 x 微升反應液（Reagent D）到所有孔里

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）到樣品活性孔里

5． 加入 xx 微升陰性液（Reagent F）到樣品背景孔里

6． 輕輕搖動 96 孔板

7． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 5 微升待測樣品（50 微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動 96 孔板

10．即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 15 分鐘讀數

11．活性計算：

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（二） 樣品非特異性活性檢測

檢測開始前，移取 5 微升待測樣品（50 微克總蛋白）到新的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升專性液（Reagent

G），混勻后，在 37℃溫度下孵育 30 分鐘，然后置于冰槽里備用

1． 在 96 孔板上做好相應標記：待測樣品

2． 移取 xx 微升緩沖液（Reagent C）到 96 孔板里

3． 加入 xx 微升反應液（Reagent D）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動 96 孔板

6． 在 37℃溫度下孵育 3 分鐘

7． 加入 10 微升上述預處理的待測樣品

8． 輕輕搖動 96 孔板

9． 即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 15 分鐘讀數

10．活性計算：

單位＝微摩爾含硫多肽底物/分鐘

（三） 樣品特異性活性計算

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樣品總活性－樣品非特異活性 ＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產品為 20 次（10 個樣本；比色皿）和 50 次（25 個樣本；96 孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 專性液（Reagent G）嚴禁反復凍融；有效期為 3 個月

5． 樣品須澄清，至關重要

6． 樣品準備要點如下：

a) 樣品中避免使用 EDTA、EGTA 等二價陽離子鰲和劑

b) 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）

c) 如果樣品中的基質金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用膠原酶潛酶活化劑（APMA）

－12197）

7． 建議使用比色皿測定

8． 如果試劑室溫下不能融化，可以置于手心焐熱融化即可

9． 樣品須澄清，至關重要

10．加樣后 3 秒內比色測定

11．測定值由低到高變化；測定可持續 15 分鐘

12．比色測定后，比色皿須清洗

13．樣本測定 15 分鐘讀數高于 0 分鐘讀數表明具有酶活性

14．待測樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為 20 微克/10 微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為 100

微克/10 微升（本公司提供 BCA 蛋白質濃度定量試劑盒 30031.1）

15．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

16．如果檢測基質金屬蛋白酶 3 抑制劑，在加入底物液（Reagent E）前，37℃下孵育 30 分鐘

17．如果檢測部分或純化酶樣品中基質金屬蛋白酶 3，則可以省去非特異活性檢測步驟

18．基質金屬蛋白酶 3 酶活性單位濃度定義：在 37℃溫度下，pH 6.0 的情況下，每單位 UK356618 敏感性

酶在單位時間內（每分鐘）水解 1 微摩爾的含硫多肽底物

19．本公司提供系列基質金屬蛋白酶檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感